Cytokeratin 19

A. 脱蜡和水化

1. 将组织切片依次置于2缸新鲜二甲苯中，各浸泡10分钟。
2. 将组织切片依次置于无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中，各浸泡5分钟。
3. 蒸馏水轻柔冲洗1分钟，冲洗后浸泡在蒸馏水中准备修复。

B. 抗原修复（高压修复）

1. 取配制好的Tris-EDTA抗原修复液（pH9.0）于高压锅中，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入修复液中，确保组织切片完全浸入修复液。
2. 盖上锅盖，扣上压力阀，大火（1600W/210℃）加热至喷气，从喷气开始计时2分钟并调至中火（800W/130℃），计时结束后，关闭电磁炉，将高压锅平稳移离热源，自然冷却5分钟。
3. 将高压锅平稳转移至水槽中，打开流水浇至锅盖，使锅盖降温，直至自动锁芯落到原位，关闭流水，取下限压阀，小心打开锅盖（注意蒸汽烫伤），再向锅内缓慢注入流水（避免流水直接冲向组织切片）。
4. 待温度降至40℃以下时（水温不烫手），取出切片架并快速浸入蒸馏水中（避免干片），用蒸馏水轻柔冲洗3分钟×2次，冲洗后浸泡在蒸馏水中准备阻断。

（注：修复后组织切片易干片，后续操作中“甩去组织切片多余液体”皆需注意不能让组织干片，否则会影响染色效果。）

C. 阻断内源性过氧化物酶

1. 甩去组织切片多余液体，将玻片快速置于过氧化物酶阻断剂（3% H2O2）中浸泡10分钟。
2. 阻断结束，用蒸馏水轻柔冲洗3分钟×2次，冲洗后浸泡在蒸馏水中准备画圈。

D. 画圈

甩去或小心拭去组织切片周围多余液体，用免疫组化油笔围绕组织画圈，画圈位置应距组织边缘2~3 mm处，确保整个圈包围全部组织后用蒸馏水轻柔冲洗3分钟×2次，冲洗掉多余油液后浸泡在PBS缓冲液中准备一抗孵育。

E. 滴加一抗或对照试剂

1. 甩去组织切片多余液体，待油笔画的圈完全显现后滴加一抗工作液使其完全覆盖组织，在湿盒中室温孵育30分钟。
2. 一抗孵育结束，用PBS缓冲液冲洗2~3次，再转移到PBS缸中浸洗2分钟×3次。

（注：实验过程中，使用PBS缓冲液冲洗组织切片时，勿直接冲洗组织表面，否则可能导致掉片。）

F. 滴加HRP酶标记的二抗聚合物

1. 甩去组织切片多余液体，待油笔画的圈完全显现后滴加一步法二抗试剂使其完全覆盖组织，在湿盒中室温孵育20分钟。
2. 二抗孵育结束，用PBS缓冲液冲洗2 ~ 3次，再转移到PBS缸中浸洗2分钟×3次。

G. 滴加DAB显色剂

1. 甩去组织切片多余液体，滴加新鲜配制的DAB显色剂使其完全覆盖组织，在湿盒中室温孵育5分钟。
2. DAB孵育结束，将玻片上的DAB震落于纸巾上，再放入蒸馏水中充分冲洗3分钟×2次，终止染色。

H. 复染、返蓝

1. 蒸馏水充分冲洗后，置于苏木素染色液中复染8 ~ 10秒，复染后用蒸馏水冲洗干净。
2. 复染后，置于1%碳酸锂溶液中返蓝8 ~ 15秒，返蓝后用蒸馏水冲洗干净。

（注：依据不同苏木素染色液的强度调整复染时间，以细胞核呈现淡蓝到深蓝颜色为宜，过染或不足染色都有可能影响结果的判断。）

I. 脱水、透明、封片

1. 甩去组织切片多余液体，将组织切片依次置于85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中，各浸泡3分钟。
2. 脱水结束，将组织切片置于新鲜二甲苯中，浸泡5 ~ 10分钟。
3. 待组织切片呈透亮状态后即可使用中性树胶和盖玻片封片。

J. 结果判读

免疫组化染色结果要由有经验的专业人员在光学显微镜下对染色后的切片进行观察并进行判读。

A. 假阴性

假阴性是指样本应存在目标抗原，但实际检测后样本无染色，呈现阴性结果。

1. 样本抗原方面

1. 离体后的组织未及时固定造成目标抗原被内源性酶溶解。（建议离体后的大体积组织在30 ~ 60 min内、穿刺组织在1 ~ 2 min内放入固定液，具体时间随实际情况而定。）
2. 离体后的组织固定时间过长造成抗原表位因过度交联而被完全遮蔽。（建议大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
3. 切片较薄造成切片组织内目标抗原含量较低。（建议石蜡切片的厚度定为3 ~ 5 μm，推荐3 μm。）

2. 试剂准备方面

1. 各种试剂因有效期已过、储存温度不当或反复冻融而失去活性。（建议各种试剂在实验前检查其有效期，在实验后储存于2 ~ 8℃环境中，为避免反复冻融可将试剂分装储存。修复液和DAB显色液应现配现用。）
2. 一抗的种类错误造成目标抗原与实际检测抗原不对应。（建议在使用一抗试剂前仔细核对所有关键信息，包括：名称、批号、克隆号、稀释比例等。）
3. 一抗的稀释倍数过大造成二抗与一抗的有效结合不足。（建议以说明书推荐的一抗试剂稀释比例进行实验，若使用其它比例应通过梯度实验进行验证。）
4. 二抗的种属反应与一抗的种属来源不匹配造成两者无法进行有效结合。（请以一抗试剂的种属来源来选择对应抗性的二抗试剂。）

3. 实验操作方面

1. 抗原修复的条件有误、时间较短、温度不足、pH值较低等原因造成抗原表位无法被打开。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 切片在抗原修复后暴露空气过久造成目标抗原位点重新封闭。（请确保切片在修复完成后始终处于湿润状态，避免干片。）
3. 一抗孵育、二抗孵育、DAB显色反应等操作的时间较短。（建议以说明书推荐的操作时间进行实验。）
4. 抗原修复→一抗孵育→二抗孵育→DAB显色反应的顺序错误或遗漏。（请严格按照说明书所记载的对应顺序的操作步骤进行实验。）
5. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过多或力度过大造成已结合的抗体被大量洗脱。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请避免直冲切片。）

B. 假阳性

假阳性是指样本不应存在目标抗原，但实际检测后样本出现染色，呈现阳性结果。

1. 样本抗原方面

1. 离体后的组织固定时间过短造成目标抗原向周围组织弥散。（建议大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
2. 组织中坏死区域的细胞结构崩解，导致大量非靶标的肽链残端释放，其可与抗体发生非特异性结合。（请尽量避免选用存在大面积坏死区域的样本进行实验。）

2. 试剂准备方面

1. 一抗或二抗因反复冻融或长期于室温放置而发生变性聚集，形成可非特异性吸附的蛋白团块。（建议试剂储存于2 ~ 8℃环境中，为避免反复冻融可将试剂分装储存。）
2. 一抗浓度过高造成多余抗体吸附于非目标抗原位点。（建议以说明书推荐的一抗试剂稀释比例进行实验，若使用其它比例应通过梯度实验进行验证。）

3. 实验操作方面

1. 抗原修复的时间过长、pH值过高、浓度过高等原因造成目标抗原位点过度暴露，甚至破坏组织结构并产生大量非目标抗原位点。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 阻断操作未进行或不充分，导致内源性过氧化物酶与DAB直接发生显色反应。（建议将切片在3% H2O2溶液中浸泡10 min以阻断内源性过氧化物酶。）
3. 各种试剂孵育时间过长或温度过高，导致试剂高度浓缩而发生非特异性吸附。（建议在室温下进行试剂孵育，并以说明书推荐的操作时间进行实验。）
4. 滴加不同种类的一抗时未更换移液枪头或误加至同一切片，导致孵育的一抗试剂发生交叉污染。（请确保每转移一支试剂后均更换一次移液枪头。为避免误加可将不同实验条件的切片安排至不同实验区域。）
5. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过少或力度不足造成游离抗体残留。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请确保液体浸润所有切片。）

4. 结果判读方面

1. 样本内的脂褐素、含铁血黄素等内源性色素被误判为阳性信号。（建议对同一样本的切片进行阴性实验以设立阴性对照。）
2. 肿瘤组织中残留的正常阳性细胞被误判为肿瘤自身的阳性信号。（可根据细胞形态进行鉴别。）
3. 正常组织中的巨噬细胞吞噬了阳性细胞的目标蛋白质，导致巨噬细胞出现阳性反应。（可根据细胞形态进行鉴别。）
4. 肿瘤细胞在破坏正常组织后吞噬了阳性细胞中的目标蛋白质，导致肿瘤细胞出现阳性反应。（该肿瘤细胞染色分布不均，常呈现不规则的空泡状或颗粒状的“包涵体”样外观。）

C. 染色较弱

1. 样本抗原方面

1. 样本本身的目标抗原含量极低。（建议使用其它样本，或以更高强度的修复和孵育条件进行实验。）
2. 样本保存时间过久造成目标抗原含量降低。（建议使用其它样本，或以更高强度的修复和孵育条件进行实验。）
3. 离体后的组织固定不及时或固定时间过长造成目标抗原位点的破坏。（建议离体后的大体积组织在30 ~ 60 min内、穿刺组织在1 ~ 2 min内放入固定液，且大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
4. 肿瘤或病变样本存在明显异质性，仅局部区域存在阳性表达。（建议分别对肿瘤的不同区域进行取样检测。）

2. 试剂准备方面

1. 各种试剂因有效期已过、储存温度不当或反复冻融而失去活性。（建议各种试剂在实验前检查其有效期，在实验后储存于2 ~ 8℃环境中，为避免反复冻融可将试剂分装储存。修复液和DAB显色液应现配现用。）
2. 一抗的稀释倍数过大造成二抗与一抗的有效结合不足。（建议以说明书推荐的一抗试剂稀释比例进行实验，若使用其它比例应通过梯度实验进行验证。）

3. 实验操作方面

1. 抗原修复的时间较短、温度不足、pH值较低等原因造成抗原表位未被充分打开。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 切片在抗原修复后暴露空气过久造成目标抗原位点重新封闭。（请确保切片在修复完成后始终处于湿润状态，避免干片。）
3. 一抗孵育、二抗孵育、DAB显色反应等操作的时间较短或温度过低。（建议在室温下进行试剂孵育，并以说明书推荐的操作时间进行实验。）
4. 一抗孵育、二抗孵育、DAB显色反应等操作中的切片未处于水平面，导致抗体流失。（请确保切片在试剂孵育时始终处于水平面位置。）
5. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过多或力度过大造成已结合的抗体被大量洗脱。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请避免直冲切片。）
6. 蒸馏水或PBS溶液洗涤后在切片上遗留过多液体，导致试剂在滴加后被进一步稀释。（建议在试剂滴加前甩去或吸收切片表面的多余液体，但请避免干片。）

D. 染色过强

1. 样本抗原方面

1. 样本本身的目标抗原含量极高。（建议将一抗试剂以更高的稀释倍数进行实验，但应提前通过梯度实验进行验证。）
2. 肿瘤或病变样本存在明显异质性，局部区域的目标抗原密度较高。（建议分别对肿瘤的不同区域进行取样检测。）
3. 离体后的组织固定时间过短造成大量游离的目标抗原暴露。（建议大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
4. 切片较厚造成单位面积内的目标抗原含量显著增加。（建议石蜡切片的厚度定为3 ~ 5 μm，推荐3 μm。）

2. 试剂准备方面

1. 一抗浓度过高造成特异性染色信号过饱和。（建议以说明书推荐的一抗试剂稀释比例进行实验，若使用其它比例应通过梯度实验进行验证。）
2. DAB显色液变质造成其催化活性异常增加。（建议DAB显色液现配现用，并在实验前检查其有效期。）

3. 实验操作方面

1. 抗原修复的时间过长、pH值过高、浓度过高等原因造成目标抗原位点过度暴露。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 阻断操作未进行或不充分，导致内源性过氧化物酶与DAB直接发生显色反应。（建议将切片在3% H2O2溶液中浸泡10 min以阻断内源性过氧化物酶。）
3. 各种试剂孵育时间过长或温度过高造成试剂的特异性结合量超过饱和阈值。（建议在室温下进行试剂孵育，并以说明书推荐的操作时间进行实验。）
4. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过少或力度不足造成游离抗体残留。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请确保液体浸润所有切片。）

E. 花斑状染色

花斑状染色是指阳性信号在样本中呈现散在斑点状、非均匀分布的异常染色模式。

1. 样本抗原方面

1. 离体后的组织固定不足造成抗原弥散，固定过度造成表位破坏，均可能导致花斑状染色。（建议大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
2. 组织中坏死区域的细胞结构崩解，导致大量非靶标的肽链残端释放，其可与抗体发生非特异性结合。（请尽量避免选用存在大面积坏死区域的样本进行实验。）
3. 单张切片的厚薄不均造成试剂渗透深浅不一，在洗涤后切片较厚区域可能仍然残留试剂。（建议石蜡切片的厚度定为3 ~ 5 μm，推荐3 μm。）
4. 摊片时切片出现褶皱或气泡，导致其下方区域试剂渗入后不易洗出。（可使用镊子轻轻拨开褶皱或戳破气泡。）
5. 载玻片的附着力不足造成切片的局部边缘起翘，导致其下方区域试剂渗入后不易洗出。（可使用防脱落载玻片，或适当增加烤片时间。）

2. 实验操作方面

1. 脱蜡溶液不净或脱蜡时间不足造成抗体无法均匀渗透。（请使用新鲜的脱蜡液或二甲苯溶液，并建议以说明书推荐的脱蜡操作进行实验。）
2. 在各种试剂孵育时试剂表面残留有气泡，导致试剂无法覆盖气泡下方区域。（可使用移液枪头戳破气泡，并轻晃载玻片以确保试剂完全覆盖组织。）
3. 在各种试剂孵育时组织边缘因试剂蒸发而干燥，导致干燥区域非特异性吸附试剂。（请将切片放置于保湿盒中以进行试剂孵育，并轻晃载玻片以确保试剂完全覆盖组织。）
4. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过少或力度不足造成游离抗体残留。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请确保液体浸润所有切片。）

F. 全片染色

1. 试剂准备方面

1. 一抗浓度过高造成特异性染色信号过饱和。（建议以说明书推荐的一抗试剂稀释比例进行实验，若使用其它比例应通过梯度实验进行验证。）
2. DAB显色液变质造成其催化活性异常增加。（建议DAB显色液现配现用，并在实验前检查其有效期。）

2. 实验操作方面

1. 抗原修复的时间过长、pH值过高、浓度过高等原因造成目标抗原位点过度暴露。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 切片在抗原修复后暴露空气过久造成全片干燥，导致干燥区域非特异性吸附试剂。（请确保切片在修复完成后始终处于湿润状态，避免干片。）
3. 切片在缓冲液浸泡过久造成组织松脱，导致试剂渗入组织背面。（请确保切片在缓冲液中浸泡不超过24 h。）
4. 阻断操作未进行或不充分，导致内源性过氧化物酶与DAB直接发生显色反应。（建议将切片在3% H2O2溶液中浸泡10 min以阻断内源性过氧化物酶。）
5. 各种试剂孵育时间过长或温度过高造成试剂的特异性结合量超过饱和阈值。（建议在室温下进行试剂孵育，并以说明书推荐的操作时间进行实验。）
6. 各种试剂孵育时未使用PBS溶液对切片进行冲洗，导致全片非特异性染色。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请确保液体浸润所有切片。）

G. 边缘效应

边缘效应是指切片边缘区域的染色强度明显高于中心区域的现象。

1. 样本抗原方面

1. 离体后的组织固定不均匀造成被保留的目标抗原存在分布差异。（建议大体积组织的固定时间为12 ~ 18 h、穿刺组织的固定时间为4 ~ 6 h，具体时间随实际情况而定。）
2. 载玻片的附着力不足造成切片的局部边缘起翘，导致其下方区域试剂渗入后不易洗出。（可使用防脱落载玻片，或适当增加烤片时间。）

2. 实验操作方面

1. 抗原修复的时间较短或温度不足造成被打开的抗原表位分布不均。（建议以说明书推荐的修复方式和操作步骤进行实验，若使用其它方式应通过实验验证。）
2. 在各种试剂孵育时试剂表面残留有气泡，导致试剂无法覆盖气泡下方区域。（可使用移液枪头戳破气泡，并轻晃载玻片以确保试剂完全覆盖组织。）
3. 在孵育时试剂未充分覆盖组织造成边缘区域试剂因蒸发而体积减少，浓度较中心区域更高而导致染色加深。（请将切片放置于保湿盒中以进行试剂孵育，并轻晃载玻片以确保试剂完全覆盖组织。）
4. 各种试剂孵育时切片未处于水平面造成试剂向一侧堆积，另一侧边缘区域浓度较中心区域更高而导致染色加深。（请确保切片在试剂孵育时始终处于水平面位置。）
5. 蒸馏水或PBS溶液的洗涤次数过少或力度不足造成中心区域的抗体残留。（建议以说明书推荐的洗涤次数和时长进行操作，并在洗涤时请确保液体浸润所有切片。）